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【产品信息】

保存:2-8℃避光，切勿冻存

效期:一年

储存液:含0.09% NaN₃的磷酸盐缓冲液(pH7.2)

【背景简介】

Annexin V(或 Annexin A5)为胞内蛋白膜联蛋白家族成员，以钙依赖的方式与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。PS存在于正常细胞浆膜的内层，但在凋亡早期，膜不对称性丧失，PS 易位至细胞表面。荧光标记的 Annexin V可与之特异性结合，表明该细胞为凋亡细胞。本试剂盒仅需 15 分钟即可染色，快速方便。

【使用方法】

一、 仪器参数调节

1. 收集1×10⁶-3 × 10⁶ 个细胞，用预冷PBS离心洗涤两次，弃上清。

2. 加入500μl Apoptosis Positive Control Solution 重悬，置冰上孵育 30 分钟。

3. 用预冷 PBS 离心洗涤，弃上清。

4. 加入适量预冷 1 × Binding Buffer 重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞与之混合。加入预冷 1 ×Binding Buffer 补充至 1.5ml，等分成三管，其中一管为空白对照管、两管为单染管。

5. 单染管分别加入 5 μl Annexin V-FITC 或 10 μl PI，室温避光孵育 5 分钟。

6. 在流式细胞仪上，用空白管调节 FSC、SSC 和荧光通道的电压，并在此电压条件下，用单染管调节荧光通道的补偿。

注：某些将贴壁细胞处理为单个细胞的过程中会造成细胞膜损伤，从而造成 Annexin V 假阳性。因此需要进行优化。强烈推荐使用对细胞更温和的 Accutase 酶 (eBioscience, 目录号 00-4555-56)处理贴壁细胞。

二、 样本检测

1. 按实验方案诱导凋亡。

2. 离心收集 1 - 5 × 10⁵ 个细胞。用双蒸水稀释 5 × Binding Buffer 为 1 × 工作液，取 500 μl 1 × Binding Buffer重悬细胞。

3. 每管加入 5 μl Annexin V-FITC 和 10 μl PI。

4. 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育 5 分钟。

5. 根据实验方法，进行流式分析(A)或荧光显微镜检测(B)。

A.流式分析

在流式细胞仪上，通过 FITC 检测通道(通常为 FL1)检测 Annexin V-FITC (Ex = 488 nm; Em = 530 nm)和通过 PE 检测通道(通常为 FL2)检测 PI。

B. 荧光显微镜检测

a. 将染色后的细胞置于载玻片上，盖上盖玻片。对于贴壁细胞，将细胞直接种在盖玻片上。在步骤 3 的染色后，将盖玻片反转盖到载玻片上。观察前可将细胞洗涤并用 2%福尔马林固定。(细胞必须在固定前孵育 Annexin V-FITC，因为细胞固定后其细胞膜被破坏，会使 Annexin V 与细胞膜内层的 PS 结合，产生人为的假阳性。)

b. 使用荧光显微镜上的 FITC 和罗丹明通道进行观察。被 Annexin V 结合的细胞显示浆膜上有绿色光环。丧失细胞膜完整性的细胞，细胞核显示红色，膜上有绿色光环。