产品简介：

    谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(Cellular Glutathione Peroxidase Assay Kit)是一种简单易行的通过紫外比色来检测细胞、组织或其它样品中谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase)活性的试剂盒。绝大部分细胞内的谷胱甘肽过氧化物酶都是含硒的，且硒为该酶的活性中性组成部分。细胞内也有很少量的不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶存在。本试剂盒检测的是最常见的含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。
    本试剂盒如果和总谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(S0058)配合使用，可以定量检测出样品中不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。
    谷胱甘肽过氧化物酶可以清除活细胞内过氧化物，在保护细胞免受自由基损伤过程中起着关键作
用。细胞内的脂类容易和自由基发生反应，产生脂类过氧化物。谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)还原脂类过氧化物，从而消除自由基的毒害作用。
    谷胱甘肽过氧化物酶几乎在所有组织中都有分布。在一些病理状况下谷胱甘肽过氧化物酶的活力会
发生明显上调或下调。
    谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)催化过氧化氢以及许多有机过氧化物，产生水或有机醇。如果以过氧化氢为底物进行检测，则同样可以分解过氧化氢的过氧化氢酶(Catalase)的酶活性会干扰谷胱甘肽过氧化物酶的测定。本试剂盒利用了一种间接测定的方法。谷胱甘肽过氧化物酶可以催化GSH产生GSSG，而谷胱甘肽还原酶可以利用NADPH催化GSSG产生GSH，通过检测NADPH的减少量就可以计算出谷胱甘肽过氧化物酶的活力水平。在上述反应中，谷胱甘肽过氧化物酶是整个反应体系的限速步骤，因此NADPH的减少量和谷胱甘肽过氧化物酶的活力线性相关。
    本试剂盒利用了如下的反应原理，GPx为谷胱甘肽过氧化物酶，GR为谷胱甘肽还原酶，R-OOH为过氧
化物。
                
                
    本试剂盒提供的有机过氧化物试剂(t-Bu-OOH)在没有谷胱甘肽过氧化物酶存在的情况下不会和GSH产生反应，也不会被细胞内的过氧化氢酶催化而分解。因而可以较为特异地检测出谷胱甘肽过氧化物酶的活力。
    由于t-Bu-OOH不能被不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶所催化，所以本试剂盒可以比较特异地定量检测
最常见的含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。
    可检测组织匀浆产物、细胞裂解产物等样品中谷胱甘肽过氧化物酶的活性。一个试剂盒可进行100次检测。
包装清单：

保存条件：
    谷胱甘肽还原酶4℃保存，其余-20℃保存，半年有效。NADPH溶解后宜-70℃保存，4℃可以保存一
天，-20℃保存一周后NADPH会减少10%以上。GSH在配制成溶液后，适当分装，-20℃保存。
注意事项：
    本试剂盒检测时牵涉到氧化还原反应，所有氧化剂或还原剂都会干扰本试剂盒的测定。如果在样品
中的还原剂无法避免，例如DTT、巯基乙醇等，则这些还原剂的总浓度至少低于0.1mM。0.15mM的DTT可以抑制40%的酶活力。
    常用的Triton X-100、Tween 20等去垢剂都含有较高水平的过氧化物，会影响本试剂盒的测定。如
果必须使用这些去垢剂，最好使用纯度较高并注明含较低过氧化物的去垢剂。
    为消除样品中可能含有的可以消耗NADPH的酶的干扰，可以检测不加过氧化物试剂的样品作为对照。
    样品可以立即测定，也可以-70℃冻存待以后测定。
    一定要严格控制反应时的温度，否则会引起较多误差。
    NADPH不太稳定，要严格按照后续说明操作，谨防失活。
    谷胱甘肽还原酶配制在接近饱和的硫酸铵溶液中，存放一段时间后容易出现硫酸铵结晶，属正常现
象。室温孵育促进晶体溶解后可继续使用。如果有水分蒸发到管壁上，则需先离心，随后再促进晶体溶解。如果出现盖子未盖紧导致水汽泄漏的情况，则需补加蒸发掉的水量，然后再促进晶体溶解。可在晶体溶解后使用，但不溶解晶体直接使用也可以，此时可以使用的酶的总体积会稍稍减小一些。
    为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. 样品的准备：
a. 细胞样品的准备：对于贴壁细胞，由于后续用于酶活性的测定，避免使用胰酶消化细胞。可以使用
   EDTA处理细胞或用细胞刮子收集细胞。细胞用PBS或生理盐水洗涤一遍。后续a1和a2步骤可以任选其
   一(优先推荐步骤a1)：
   a1.可以用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)参考相应说明裂解细胞样品。按照每100万细
   胞加入100-200微升裂解液的比例进行裂解。如果出现裂解效果不佳的情况，可以把处在裂解液中的
   细胞样品用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。随后4℃，12000g离心10分钟。取上清用于酶活性的测定。
   a2.可以用本试剂盒中的匀浆液，按照每100万细胞加入100-200微升匀浆液的比例用玻璃匀浆器在4℃
   或冰浴匀浆。随后4℃，12000g离心10分钟。取上清用于酶活性的测定。进行匀浆处理。
b. 组织样品的准备：动物用含有0.16mg/ml heparin的生理盐水(0.9% NaCl containing 0.16mg/ml
   heparin)灌流清除血液后获取组织样品。按照约每20mg组织加入200微升匀浆液的比例，用玻璃匀浆
   器在4℃或冰浴匀浆。4℃，12000g离心10分钟。取上清用于酶活性的测定。
c. 红细胞裂解液的准备：用抗凝管收集血液，颠倒混匀。取至少500微升全血4℃ 2500g离心5分钟。
   弃上清，用冰冷的约红细胞沉淀10倍体积的匀浆液重悬沉淀，再同前离心，弃上清。加入约红细胞沉
   淀4倍体积的冰冷的Milli-Q级纯水裂解红细胞。12000g离心5分钟，取上清。
d. 上述各种样品可以用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/
   P0012S)测定蛋白浓度。通常可以先取含20-100微克蛋白的样品用于检测。如果发现样品中谷胱甘肽
   过氧化物酶的活力过高，可以用谷胱甘肽过氧化物酶检测缓冲液进行稀释。如果样品中谷胱甘肽过氧
   化物酶的活力过低，则需适当加大蛋白用量。准备好的样品如果当日测定，可以在冰浴保存，如果日
   后测定可以-70℃冻存。
2. 试剂盒的准备工作：
a. 配制10mM NADPH。取2.5mg NADPH，加入300微升Milli-Q级纯水或重蒸水，溶解，混匀。预计多余的
   NADPH需立即分装，-70℃保存。
b. 84mM GSH溶液的配制。在14mg GSH中加入550微升 Milli-Q级纯水，溶解并混匀。或称取少量GSH，配
   制少量84mM GSH溶液。预计多余的GSH需立即分装，-20℃保存。
c. GPx检测工作液的配制。根据待测定的样品数(含对照)，参考下表配制适当量的GPx检测工作液。配制
   好的GPx检测工作液仅限当日使用，且需尽量在冰浴上存放。