产品简介：

    碧云天的细胞凋亡－DNA Ladder抽提试剂盒(离心柱式)(Apoptosis, DNA Ladder Extraction Kit with Spin Column)是目前最先进的DNA Ladder抽提试剂盒之一。本试剂盒是针对细胞凋亡过程中产生的核小体间DNA链断裂而设计的。可以非常有效地抽提最小片断为180-200bp的DNA ladder，同时又可以抽提到最大50kb左右的基因组DNA。
    DNA ladder也称DNA fragmentation，是细胞凋亡的一个重要指标。通常观察到DNA ladder，就可以判定细胞发生了凋亡。
    样品首先被蛋白酶K消化，随后加入适合DNA结合到纯化柱上的缓冲液，然后加入到纯化柱内。通过高速离心，使DNA在穿过纯化柱的瞬间，结合到纯化柱上，随后通过两次洗涤去除各种杂质，最后通过洗脱液把DNA洗脱下来。整个过程无需酚氯仿抽提，无需酒精沉淀，样品裂解后仅需约15分钟即可完成。
    通过DNA纯化柱方式抽提DNA ladder比用传统的酚氯仿抽提酒精沉淀方法更加便捷，小片断DNA不容易损失。
    本试剂盒每次最多可以抽提20mg组织或200-350万个培养细胞。样品用量过多，反而会影响抽提效果。
    试剂盒提供了RNase A，可以获得不含RNA的高纯度总DNA，排除了RNA对DNA ladder观察造成的干扰。
    纯化柱对于DNA的最大容量约为30微克。通常每200万Hela细胞或500万淋巴细胞可以抽提得到15-25微克总DNA，每25mg肝、脑、肾组织可以抽提得到10-30微克总DNA，每25毫克心、肺组织可以抽提得到5-10微克总DNA，每10mg脾组织可以抽提得到5-30微克总DNA。样品的用量请勿超过纯化柱的容量，样品用量最好能保持在纯化柱容量的70%或以下。当然过少的样品也不利于检测到DNA ladder。
    对于培养细胞的凋亡检测，通常6孔板一个孔的细胞就足够用于DNA ladder的抽提和检测。
    本试剂盒可以抽提50个样品。
包装清单：

保存条件：
    蛋白酶K-20℃保存，其余均室温保存。一年有效。蛋白酶K室温(15-25℃)存放一周，活力无明显下
降。
注意事项：
    温度较低时样品裂解液A或样品裂解液B中可能会有沉淀产生，属正常现象。使用前必须检查一遍。如有沉淀，55℃水浴孵育使沉淀溶解，混匀后使用。
    第一次使用前洗涤液I需添加7ml无水乙醇，洗涤液II需添加24ml无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。
    本试剂盒需使用55℃或70℃水浴，请提前作好准备。
    除特别说明外，每次Vortex应控制在5-10秒左右。
    本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
    废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。
    为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.从培养的动物细胞中抽提并检测DNA ladder
  a．收集约100万个细胞，离心沉淀，弃上清。加入200微升PBS，轻轻吹散或弹散细胞，使细
     胞重悬于PBS中。
      需自备PBS。如果使用冻存的细胞沉淀，先把细胞沉淀解冻，并轻轻弹散，然后再加入PBS重悬细
      胞。
  b．加入4微升RNase A，Vortex混匀。室温(15-25℃)放置3-5分钟。
  c．加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀。
  d．加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
      加入样品裂解液B后必须立即Vortex混匀。不可把蛋白酶K直接和样品裂解液B混合。
  e．加入200微升无水乙醇，Vortex混匀。
      加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能产生白色沉淀，属正常现
      象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内。
  f．把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液
     收集管内液体。
      进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
      注意：必须把沉淀全部转移到DNA纯化柱内，否则会严重影响抽提效果！
  g．加入500微升洗涤液I，≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
      进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
  h．加入600微升洗涤液II，≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
      进行本步骤前需把纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
  i．再≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟，以去除残留的乙醇。
      不可把步骤h的离心时间延长而省略本步骤。倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。
  j．将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上，加入50-100微升洗脱液。室温放置1-3分钟。
     ≥12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。
      洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果有必要，可以使用去离子
      水或TE进行洗脱。使用较小体积的洗脱液可以使获得的总DNA的浓度较高，但洗脱下来的DNA量相
      对较少。
  k．取部分抽提得到的DNA，1%琼脂糖凝胶电泳分析。如果细胞发生凋亡，即可观察到典型的DNA
      ladder。电泳时一定要注意换用新鲜配制的电泳液，DNA凝胶也要用新鲜配制的电泳液配制并新鲜
      配制后使用。电泳时为获取最佳的电泳效果使ladder充分分开，电泳速度宜适当慢一些，凝胶宜
      适当长一些，而加样孔宜更加扁平一些。选取适当较薄的梳齿，往往会获得更好的ladder电泳效
      果。
2.从动物组织中抽提并检测DNA ladder
  a．取不超过25mg的组织(脾不超过10mg)，剪切成尽可能小的碎片，加入180微升样品裂解液
     A。
      请勿使用过多的样品，过多的样品会导致抽提效果下降。较小的组织碎片会使裂解速度加快，裂
      解效果提高。新鲜或冻存的组织均可，但固定过的组织请参考后续的其它步骤进行。
  b．加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀，55℃水浴孵育至完全裂解。
      在孵育期间可以偶尔取出样品Vortex以加快裂解速度。裂解的时间因组织不同而有所不同，通常
      可在1-3小时内完成。为方便起见，可以直接裂解过夜，裂解过夜对抽提效果无任何负面影响。组
      织完全裂解后可以呈粘稠状，但不应该呈可把DNA纯化柱堵住的凝胶状。如果消化过夜仍呈凝胶
      状，说明样品用量过多，作为补救措施，可以把整个反应体系放大一倍。
  c．加入4微升RNase A，Vortex混匀。室温(15-25℃)放置3-5分钟。
  d．最高速剧烈Vortex 15秒。加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
      加入样品裂解液B后需立即Vortex混匀。加入样品裂解液B后可能会产生白色沉淀，但大多数情况
      在70℃孵育后会溶解。即使70℃孵育后仍有白色沉淀也不会干扰后续实验。有些组织例如肺、
      脾，在加入样品裂解液B后可能会形成凝胶状物，此时需剧烈晃动或Vortex样品，以尽量破坏凝胶
      状物。
  e．转步骤1.e，后续步骤同“从培养的动物细胞中抽提总DNA”1.e起的步骤。